Laporan Praktikum Genetika Molekuler Laboratorium Bio.5

Nama               : Eko Riana                                         1. Hayatul Fajri G34062152

NRP                : G34070097                                       2. Indah Hayati G34060868

Kelompok       : 3

Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

Pendahuluan

Salah satu sebab cepatnya perkembangan teknologi DNA adalah penemuan berbagai macam enzim yang dapat mengkatalisis pembelahan DNA di beberapa tempat yang dapat di produksi. Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda. Enzim yang dihasilkan oleh berbagai jenis bakteri dan secara alami berfungsi untuk melindungi bakteri dari inkorporasi DNA asing. Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan inangnya, misalnya EcoRI berasal dari bakteri E. coli. Dalam biologi molekuler, enzim restriksi biasanya digunakan untuk analisis kekerabatan, rekayasa genetika dan identifikasi suatu molekul DNA. (Anonim 2010).

Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi tertentu, dan ini merupakan salah satu tujuan dilakukannya pemotongan DNA. Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks organisasi DNA-nya dapat dipotong-dipotong menjadi populasi potongan DNA dengan berbagai ukuran. Sampai dengan tahun 1988an, telah diketahui hampir 475 macam enzim restriksi yang berasal dari berbagai organisme. Situs pengenalan enzim restriksi kebanyakan terdiri dari empat basa atau enam basa, tetapi ada juga yang selain itu. Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda. Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca dengan arah yang sama. Sekuen ini disebut palindromik. Berdasarkan ujung hasil pemotongannya, enzim restriksi dapat memotong dengan ujung lengket/lancip (sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end). Enzim yang memotong pada kedua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI.
Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI,MspI dan lain-lain.

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi.

Hasil Pengamatan

Keterangan: a. Marker  1 kb b. Plasmid pGEM-T easy c. Genom d. Plasmid (kelompok 3)

Pembahasan

Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada senbarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (Tjahjoleksono 2009).

Dari hasil running elektroforesis terlihat masih adanya genom yang terdapat pada agarosa, dan ada pada semua kelompok. Tentu saja hal ini merupakan suatu kesalahan yang terjadi, yang seharusnya hanya plasmid yang ter-running dalam agarosa tersebut. Hal ini disebabkan kemungkinan terjadi pada saat proses pengambilan plasmid, ketika proses pelisisan membran oleh EDTA. Kemungkinan karena kurang sempurnanya proses tersebut tidah hanya plasmid yang terambil atau terbawa, tetapi juga ikutnya DNA genom yang ukurannya lebih besar dibandingkan plasmid.

Simpulan

DaftarPustaka

[Anonim].2010. http://infobioteknologi.com/penemuan-molekul-dna-yang-mempunyai.html [20 Maret 2010]

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000.Molecular Cell Biology. New York: Wh. Freeman Company

Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.

Nama    : Eko Riana                                                                                                                          Tugas Ilmu Lingkungan

NRP       : G34070097

Perlu Pembenahan Besar Ekoturisme Indonesia

MenbudparCemaskanMulaiTertinggalnya Bali dari Galapagos PerluPembenahanBesarEkoturisme Sanur, Pelita Menteri Kebudayaan  dan Pariwisata (Menbudpar) Jero Wacik menyerukan agar semua pihak terlibat dalam pembenahan ekoturisme Indonesia, sehingga mampu memberikan manfaat bagi masyarakat local dan bagi upaya pelestarian lingkungan dan budaya, terutama melihat trend kunjungan yang kembali kealam (back to nature). Potensi (ekoturisme) kita sangat besar namun kita lemah dalam pengemasannya. Kita harus benahi produk itu termasuk 50 taman nasional yang ada di Indonesia, harus dipilih prioritas dan kita perlu promosi yang lebih spesifik, katanya. Hal itu disampaikan usai menjadi pembicara pada Konferensi FEALAC (Forum of East Asia and Latin America Cooperation) tentang Ekoturisme, yang diikuti delegasi 24 negara Asia Timur dan Amerika Latin, di Sanur, Bali, Kamis (17/7). JeroWacik mengaku cemas dengan perkembangan pariwisata khususnya di Bali yang kini sudah tertinggal dari Pulau Galapagos. Itu terjadi, menurut Wacik, karena semua pihak tidak terlibat untuk berbuat sesuatu. Kita hanya bangga saja, kita kurang berbuat sesuatu. Ini bukan hanya tugas pemerintah tapi tugas kita semua, kata dia. Selain pengemasan produk dan promosi, juga diperlukan peraturan-peraturan pendukung ditingkat lokal yang berisi panduan-panduan bagi wisatawan.  Di Bali sendiri ada Taman Nasional Bali Barat. Tapi hingga saat ini belum dikemas dengan baik, bahkan tidak didukung oleh panduan-panduan pendukung, misalnya untuk Bird Wacthing (Pengamatan Burung-Red) tidak ada penjelasan kapan waktu, rute, dimana untuk bisa mengamati Burung Jalak Bali. Hal yang sama juga terjadi di berbagai taman nasional lain, misalnya di Taman Nasional Gede Panggrango di Jawa Barat. Dirjen Destinasi Pariwisata, Depbudpar Firmansyah Rahim mengatakan negara-negara FEALAC memiliki jumlah penduduk 2,5miliar, merupakan pasar potensial bagi ekoturisme Indonesia. Melalui konferensi ini Indonesia berupaya mengumpulkan banyak pemikiran dari negara-negara FEALAC yang memiliki berbagai pengalaman dalam melaksanakan konsepekoturisme. Demikian sebaliknya, negara lain juga bisa belajar dari Indonesia dalam menggarap produk ekoturisme, seperti yang ada di Bali. Indonesia, menurut Firmansyah, mengadopsi ekoturisme pada 1995 dan merupakan isu yang sangat ramai dibahas global saat ini, karena dalam konsep ekoturisme ada kandungan edukasi, pemberdayaan masyarakat local dan pemeliharaan lingkungan hidup. Sementara DirekturKerjasama Intraregional EropadanAmerika, Deplu RI Dian Wirengjuritmenjelaskan, FEALAC masihberusiamuda, memilikikewajibanuntukmelaksanakansecarakonkretberbagaikeputusan. Konferensiekoturisme yang pertamainimerupakanusulan Indonesia danmudah-mudahanapa yang dilakukanoleh FEALAC tidakberhentisampai di sini, tapinantiakandiadakanbergantian, denganbegitu FEALAC bisamengikutijejak APEC, katanya. (jon) Sumber: HarianUmum PELITA ,edisirabu 24 Maret 2010 www.pelita.or.id

Laporan Praktikum Genetika Molekuler Laboratorium Bio.5

Nama               : Eko Riana                                         1. Hayatul Fajri G34062152

NRP                : G34070097                                       2. Indah Hayati G34060868

Kelompok       : 3

Isolasi Plasmid, Elektroforesis, Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer

Pendahuluan

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebaga DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat bereplikasi secara terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI (Origin of replication) (Anonim 2010).

Prinsip dasar elektroforesis adalah pergerakan molekul bermuatan atau ion melalui medium semisolid di bawah pengaruh suatu medan listrik. Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Medium yang sering digunakan dalam elektroforesis DNA adalah gel agarosa (Stansfield et al. 2003).. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mundah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu(Lodish et. al. 2004).

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan dapat mengisolasi plasmid untuk vektor kloning, mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA, menganalisis kualitas DNA, dan mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarosa.

Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data Hasil Spektrofotometri DNA Plasmid
Kelompok	[DNA]	A230nm	A260nm	A280nm	Kemurnian 260/280
1	20020	1,538	2,002	1,287	1,096
2	19780	1,511	1,978	1,740	1,137
3	19710	1,501	1,971	1,731	1,139
4	19710	1,507	1,971	1,668	1,182
5	19650	1,494	1,965	1,693	1,162
6	19790	1,500	1,979	1,790	1,106
7	19910	1,532	1,991	1,803	1,104
8	19950	1,221	1,995	1,821	1,096
9	19720	1,495	1,972	1,811	1,089
10	20110	1,547	2,001	1,872	1,074

Contoh perhitungan (data kelompok 3) :

Dik  : A₂₆₀ = 1,971 A

A₂₈₀ = 1,731 A

Dit  : [DNA] dan kemurnian DNA plasmid?

Jawab: [DNA]  = A₂₆₀ x 50 gr/ml x Fp

= 1,971 x 50 x (1500/10)

= 1,971 x 50 x 150

=  14782,5

Kemurnian DNA plasmid = A₂₆₀

A₂₈₀

= 1,971

1,731

= 1,139

Gambar 1.Hasil Elektroforesispergerakan DNA pada gel Agarosa

Keterangan : 1. Fage λ 20 nm/ µl 2. Fage λ 30 nm/ µl 3. Fage λ 50 nm/ µl 4. Visualisasi DNA kelompok 3 (a. DNA Superkoil, b. DNA linier)

Contoh perhitungan :

Bobot DNA   =  3(10 nm/µl) + 3(50 nm/µl)

= 30 nm/µl + 150 nm/µl

= 180 nm/µl

Ukuran  DNA total =       bobot DNA

ml DNA yang dipindahkan ke sumur

= 180 nm/µl

5 µl

= 36 nm/µl

Pembahasan

Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk supercoiled.

Hasil elektroforesis yang diperoleh dari sepuluh kelompok berbeda dengan kelompok lain pada agarose yang sama meskipun dengan sampel yang sama. Pita teratas dari kelompok 3 terdiri dari dua pita (linier dan superkoil) sedangkan pada kelompok lain hasilnya bervariasi, terdiri dari satu pita, dua pita, tiga pita, atau bahkan ada yang tidak terlihat visualisasi pitanya. Ada beberapa penyebab mengapa pita tidak tervisualisasi sempurna contohnya pada kelompok yang hanya terdapat satu pita yang terlihat, kemungkinan pita yang sebenarnya ada dua atau tiga tertumpuk menjadi satu. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya pita ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis yang dilakukan. Dari hasil penghitungan Bobot DNA yang terlihat dari hasil visualisai sebesar 180 nm/µl, dengan ukuran DNA total 36 nm/µl. Nilai ini didapat dari penghitungan melalui perbandingan dengan DNA marker.

Pengujian lain selain elektroforesis adalah pengujian kualitas DNA plasmid hasil isolasi dengan menggunakan spektrofotometer. Kualitas DNA dilihat dari kemurniannya yang dapat dihitung dari rasio absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi DNA pada panjang gelombang 280 nm. Berdasarkan data yang diperoleh, dapat diketahui bahwa sampel DNA yang diuji memiliki konsentrasi sebesar  14782,5 setelah melalui proses pengenceran dan kemurnian DNA plasmid 1,139.  Dari data kemurnian tersebut, diketahui bahwa DNA plasmid yang diuji tidak murni atau mengandung kontaminan protein, karena nilai kemurniannya dibawah 1,8, yang seharusnya jika DNA plasmid itu murni memiliki rasio OD₂₆₀ berbanding OD₂₈₀ lebih atau sama dengan 1,8.

Simpulan

Pengisolasian Plasmid diperoleh dari Eschericia coli dan dari hasil menunjukan hanya bentuk linear dan superkoil. Berdasarkan perhitungan spektofotometer, konsentrasi DNA plasmid adalah 14782,5 ng/ µL, dengan kemurnian 1,139 yang dapt disimpulkan bahwa DNA plasmid yang diuji tidak murni atau terkontaminasi.

DaftarPustaka

[Anonim].2010.http://www.biocompare.com/forums/ViewThread.aspx?threadid=463. [20 Maret 2010]

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000.Molecular Cell Biology. New York: Wh. Freeman Company

Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.

heloooo